西部馬腦脊髓炎病毒PCR檢測試劑盒反應流程常規(guī)程序

將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持分鐘（擴增kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的DNA段大量累積。后，在72℃保持3-7min，使產物延伸完整，4℃保存。

2．復性（退火）和延伸溫度

復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應時間

變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用kb用分鐘來保證充足的時間。

4．循環(huán)次數

循環(huán)次數主要與模板的起始數量有關，在模板拷貝數為04～05數量級時，循環(huán)數通常為25～35次。

平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產物的積累按減弱的指數速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產物抑制作用，非特異性產物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不*。

5．PCR反應液的配制

PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣，在后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。