非洲豬瘟病毒PCR定量試劑盒組成及試劑配制:

、酶標板：一塊（96孔）

2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前5分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約0分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，00 U/L，50 U/L，25 U/L，2.5 U/L，6.25 U/L，3.2 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制00 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：×20ml。

4、 檢測稀釋液A：×0ml。

5、 檢測稀釋液B：×0ml。

反應五要素：

參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 5-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至0kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。