小鼠子宮平滑肌細(xì)胞實驗操作步驟

細(xì)胞傳代與凍存

當(dāng)原代細(xì)胞生長至80%-90%融合時，即可進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS輕柔沖洗兩次，加入0.25%（含0.02%EDTA）消化1-2分鐘。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓后，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，用移液管輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。以1000rpm離心5分鐘后，按1:2或1:3比例傳代至新的培養(yǎng)瓶中。

對于細(xì)胞凍存，取對數(shù)生長期細(xì)胞，按常規(guī)方法消化后計數(shù)，用含10%DMSO的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1×10?/mL，分裝至凍存管中，采用程序降溫盒進(jìn)行梯度降溫（4℃30min→-20℃2h→-80℃過夜），最后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。

功能實驗設(shè)計

（1）收縮功能檢測：可采用膠原凝膠收縮實驗，將細(xì)胞與膠原混合后接種于24孔板，待凝膠形成后觀察收縮情況；或使用微流控芯片模擬三維收縮環(huán)境。

（2）鈣成像實驗：加載Fluo-4 AM鈣離子熒光探針后，通過共聚焦顯微鏡實時記錄細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變，分析激動劑（如催產(chǎn)素）刺激下的鈣信號變化。

（3）電生理研究：采用膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞膜電位及離子通道電流，特別注意大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa）的特征性電流。

數(shù)據(jù)收集與分析

所有實驗需設(shè)置至少3個生物學(xué)重復(fù)。收縮實驗數(shù)據(jù)建議采用ImageJ軟件量化凝膠面積變化；鈣信號數(shù)據(jù)使用Clampfit或Igor Pro進(jìn)行峰值分析；電生理數(shù)據(jù)需校正電容電流。統(tǒng)計方法推薦采用Student's t檢驗（兩組比較）或單因素方差分析（多組比較），顯著性水平設(shè)為p<0.05。

?注意事項：

1. 子宮平滑肌細(xì)胞對機(jī)械刺激敏感，所有操作需動作輕柔

2. 原代細(xì)胞建議在3-5代內(nèi)完成實驗以保證表型穩(wěn)定

3. 功能實驗前需進(jìn)行α-SMA免疫熒光鑒定（純度應(yīng)>90%）

4. 不同動情周期獲取的細(xì)胞可能存在功能差異，需記錄動物生理狀態(tài)